Alyssa Jayne Milano est née le 19 décembre 1972 dans le quartier de Brooklyn à New York. Elle est la fille de parents italo-américains : Tom, un éditeur de musique de films, et Lyn, styliste de mode. Elle a un frère prénommé Cory Milano (né en 1982).
Alyssa a commencé sa carrière artistique à l'âge de huit ans dans la comédie musicale Annie. Accompagnée par sa mère, qui a décidé de sacrifier sa carrière pour gérer celle de sa fille, elle part avec sa troupe pour une tournée de dix-huit mois à travers les États-Unis. Elle apparaît aussi à la télévision dans des publicités commerciales.
Aux cours des années 1980, elle joue dans diverses pièces de théâtre dont Tender Offer de Wendy Wasserstein et All Night Long de l'écrivain américain John O'Keefe. Elle joue aussi dans la première adaptation musicale de Jane Eyre.
En 1983, elle décroche le rôle qui va la rendre célèbre: celui de Samantha Micelli dans la sitcom Madame est servie (Who's the Boss?), diffusée aux États-Unis sur le réseau ABC à partir de 1984. Elle donne la réplique à Tony Danza, qui incarne son père à l'écran, ainsi qu'à Judith Light, Katherine Helmond et Danny Pintauro. Sa famille s'installe à Hollywood où la série est tournée. Elle fait ses débuts au cinéma dans Tendres années (Old Enough) avec Danny Aiello, puis elle incarne la fille d'Arnold Schwarzenegger dans Commando en 1985. Enfin, elle produit une vidéo de fitness pour adolescentes en 1988 intitulée Teen Steam.
Au début des années 1990, elle enregistre cinq albums: Look in My Heart, Alyssa, The Best in the World, Locked Inside a Dream et Do You See Me? et sort un album best of en 1995intitulé The Very Best of Alyssa Milano. Alyssa fait un carton en Asie et tout particulièrement au Japon où elle bat les records de ventes de Madonna ou encore des Rolling Stones. Ses albums sont tous disques de platine au Japon. Elle revient au théâtre en 1991 et joue à Los Angeles dans Butterflies Are Free.À la mi-saison, elle devait être l'héroïne de Single with Parents, une nouvelle série télévisée du réseau américain ABC mais la chaîne s'est une nouvelle fois rétractée .
Elle a écrit un livre sur le baseball intitulé Safe at Home: Confessions of a Baseball Fanatic , et s'est mariée le 15 août 2009 à David Bugliari, un agent artistique . Elle a été l'héroïne d'une toute nouvelle série d'ABC intitulée Romantically Challenged mais celle-ci a été annulée après la diffusion de seulement quatre épisodes. En 2011 elle fait une apparition au cinéma dans le film Bon à tirer (B.A.T.). En février 2011, elle a annoncé qu'elle était enceinte d'un petit garçon..
